Enzymatická Immunoassay ELISA


Enzymoimuno (ELISA) - Moderní laboratorní výzkum, ve které hledané specifické protilátky nebo antigeny v krvi na konkrétní onemocnění, k identifikaci nejen etiologie, ale i na stupni onemocnění. Výsledky ELISA může zdát kvalitativně a kvantitativně.

V současné době ELISA se používá v následujících situacích:

1) Hledat pro specifické protilátky proti jakékoliv infekční choroby;
2) antigeny hledat nějaké onemocnění (infekční pohlavní);
3) studovat hormonální stav pacienta;


4) testování nádorových markerů;
5) vyšetření na přítomnost autoimunitních onemocnění.

Výhody metody ELISA:

1) vysoké specificity a senzitivity testu ELISA (více než 90%).
2) Schopnost určit a sledovat dynamiku procesu onemocnění, tj srovnání počtu protilátek v různých časových intervalech.
3) dostupnost ELISA diagnostiku v každém zdravotnickém zařízení.

Relativní nedostatek:

1) Detekce imunitní odpovědi (protilátky), ale ne z patogenu.

Základní pojmy

Před objasnit podstatu metody ELISA, stručně pochopit některé pojmy.

Protilátky (nebo imunoglobuliny - Ig) - Specifické proteiny produkované B -
lymfocyty (buňky imunitního systému) v reakci na pozitivní nález v těle infekčních patogenů (viry, bakterie, plísně, atd.) Tam imunoglobulinu A (IgA), imunoglobulin E (IgE), imunoglobulin M (IgM), imunoglobulin G (IgG), imunoglobulin D (IgD). Liší se od sebe navzájem a tvoří molekulová hmotnost, poločas, účast / neúčast infekčního procesu, časování detekce po infekci. Pokud vezmeme v úvahu molekulové hmotnosti, nejvíce he IgM - to pentamer (950 000 Da), na rozdíl od ostatních Ig (150-200 000 Ano), takže IgM prostě nemůže projít placentární bariérou. Proto, detekce IgM v podřízeném 1 roku života, je vždy známkou infekce u plodu. Sérové ​​imunoglobuliny představoval většinu z toho IgG (75-85%) a nejnižší - IgE (0003%). V infekčního procesu trvat jen přímou součástí IgA, M, G. IgE je známkou alergických reakcí a onemocnění, a IgD - lze nalézt pouze v lymfatických uzlinách a mandle tkáně, hraje roli při tvorbě lokální imunitu.

Třídy imunoglobulinů

Antigeny - Makromolekulární látky organického původu, včetně infekčních a jiných onemocnění, stejně jako různé látky změněných buněk tvořená jedním nebo jinou nemocí (autoimunitních chorob, onkologických onemocnění).

Imunitní komplex - Komplex antigen-protilátka, která se podílí na imunitní procesu.

Co metoda založená na ELISA.

Existuje několik druhů ELISA (přímá, nepřímá metoda blokování, konkurenční), ale v praxi často používají heterogenní pevné fázi imunitní analýzu nebo ELISA (enzymatický linked immunosorbent assay)

Základem ELISA imunitní odpověď antigenu a protilátky za vzniku imunitního komplexu: antigen-protilátka, což vede ke změně enzymatické aktivity specifických etiket na povrchu protilátky.

Metoda IFA

Jednoduše řečeno, tento proces může být rozdělena do několika fází:

1) povrchové otvory tablet lékař zkoušející je vyčištěný antigen specifický patogen. Přidáním biologický materiál (krevní sérum) je pacient specifická reakce mezi antigenem a požadované protilátky (imunoglobulinu). Toto spojení se bude působit jako "speciální antigenu" v následujícím stupni.

2) V této fázi je tvorba IR (imunokomplexy) - reakce mezi "specifický antigen" a konjugátu (to imunoglobulinu značená peroxidázou enzymu). Zvláštní chromogen je přidán. Výsledkem této enzymatické reakce je tvorba barevných látek v díře tablety, intenzita zbarvení závisí na množství obsaženého v materiálu imunoglobulinů pacienta (protilátky).

3) Poté, celkový výsledek: fotometryrovanye pomocí vícekanálového spektrofotometru, porovnáním optické hustotě materiálu testů optické hustotě kontrolních zkoušek, matematické zpracování výsledků. Počet protilátek u pacienta je závislá na výšce optickou hustotou jamek.

Obvykle se v praxi, s použitím 96-jamkových destiček.

Při měření optické hustoty (OP), počítá množství testovací tekutiny (nebo koncentrace) protilátky v určitém jednotku objemu. Výsledky jsou pak porovnány s kontrolním vzorkem.

Je třeba mít na paměti:pro každý testovací systém vyvinutý individuální indikátory pro účetních výsledků, výkonnosti norem a patologie (tj "referenční hodnoty"). To by se mělo vzít v úvahu při hodnocení výsledků každé jednotlivé studie. Nesprávně interpretovat výsledky jediné laboratoři na "referenčních hodnot", jiné laboratoře. Nesprávné také porovnat výsledky různých laboratoří s sebou.

Při stanovení ELISA reakce a důležité pojmy, jako jsou protilátky avidity.
Avidita protilátky - To je síla vazby s antigenem a protilátkou a množství antigenu, které je ve spojení s immnohlobulinami (protilátky). Avidita je důležité pro posuzování předpovězený čas infekce, která je nesmírně důležitá v diagnóze primární infekce u těhotných žen.

Základem protilátka avidity testu se skládá ze zpracování imunitní komplex (antigen-protilátka) roztoku močoviny zničit protein. Vysokoavidni připojení zůstat neporušené a nyzkoavidnyh zničeny. Výsledek je uveden ve formě indexu avidity, vyjádřený v procentech (%).

Jaké nemoci jsou detekovány ELISA diagnostika?

1. Infekce
1,1 Virová hepatitida (IgM, G), B antigeny -HBsAg, HBeAg, protilátky - IgM HBcorAg, Ig celkový HBcorAg, IgG, HBeAg), C (protilátky Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (Ig M, G) a další.
1.2 infekce HIV (IgG)
1.3 Tsytomehalovyrusnaya infekce (protilátky IgM, G)
1,4 virus Epstein-Barrové, nebo infekce mononkleoz (IgM protilátek, G k EA, VCA, NA proteiny viru)
1.5 herpetické infekce (protilátky IgM, G)
1.6 toxoplazmóza (IgM protilátek, G)
1,7 Rubella (IgM, G)

1.8 Spalničky (IgM, G), brucelóza (IgM, G), pseudotuberculosis (IgM, G), salmonellezom (IgM, G), Shyhellez nebo úplavice (IgM, G), aspergilóza (IgM, G), klíšťové encefalitidě a borreliózy mnoho dalších.
1.9 parazitózy (giardiasis, toxocarosis, trichinóza, opisthorchiasis, echinokokóza, alveokokkoz a další), v nichž IgG detekován
1,10 STD (nemoci přenášené pohlavně) - mykoplazmóz (IgM, G), ureaplasmosis (IgM, G), chlamydie (IgA, M, G), syfilis (IgG)
1.11 pylori (IgG)

2. Markery autoimunitních onemocnění a lidské imunitní parametry (celkový IgE, celkový IgG, IgA celkem, celkem IgM, IgD celkem, sekreční IgA, IgG2, IgG4, CEC-cirkulujících imunokomplexů, IgA a IgG gliadinu, atd.),

3. Onkolohichsekie markery (TNF - tumor nekrotizující faktor, CEA - karcinoembryonální antigen, PSA - prostatspetsyfichnyy hCG antigen - choriogonadotropin, CA 125, alveomutsin a mnoho dalších)

4. Reprodukční poruchy (estradiol, progesteron, prolaktin, testosteron, AFP- alfafetoproteyn, FSH - folikuly stimulující hormon a další)

5. štítné žlázy (volný a vázaný T3, T4, thyroglobulin, tireoperoksidaze - TPO, štítné žlázy stimulující hormon - TSH).

Tento seznam je uveden ne všechny nemoci jsou diagnostikovány pomocí ELISA.

Materiál pro ELISA analýzu a pravidly plotu

Nejběžnějším materiálem pro ELISA reakcí - krevním séru pacienta, které bylo přijato na lačný žaludek. Materiál může také sloužit jako mozkomíšní mok, plodová voda, skelných obsahu, hlenu děložního hrdla a močové trubice tampony.

Příprava pacientů na dodávku materiálu pro ELISA

Krev je brát na prázdný žaludek. Před tím, než krev nemusí brát žádné léky. Specifická léčba (antibakteriální, antivirové, protyvoparazytarnoe atd.), By měli přestat nejméně 2 týdny před studii.

Podmínky IFA výrobní

Enzymatická imunoanalýza materiál je rychlé, přes noc. Zpoždění může být v různých laboratořích v důsledku nahromadění řady sér.

Možné výsledky ELISA diagnostiky

Při posuzování výsledků na konkrétní infekce důležité třídy protilátek a jejich počet. Na to závisí nejen etiologie infekcí (nebo nemusí), ale také předvídatelné stadium onemocnění (akutní, chronické), a za přítomnosti aktivní infekce (akutní nebo exacerbace chronické) v době průzkumu.

Jaké jsou přibližné načasování vzhledu protilátek (imunoglobulinů - Ig)?

Nejdříve protilátky jsou IgM. Identifikace mohou být 1-3 týdny po možné infekce, charakterizující akutní fázi infekce. Druhý případ je výskyt protilátek IgM - aktivace (nebo zhoršení) chronické procesu. IgM protilátky obíhat v průměru asi 3 měsíce, a pak se jejich počet postupně mizí. Nicméně u některých pacientů, stopová množství IgM může dojít během 1-2h let infekce.

Moderní testovací systémy s vysokou citlivostí, což vede k falešně pozitivním výsledkům jsou nespecifické (často u těhotných žen). Proto se v této skupině pacientů pozitivních IgM by měly být testovány!

IgA protilátky se objevují 2 až 4 týdny po infekci, ale v množství, které postačuje k identifikaci - za měsíc. Sérum IgA syntetizován plazmatických buněk sleziny, lymfatických uzlin a sliznic, sekreční IgA soustředěných na sliznicích plnit svou ochrannou funkci - účast v místním imunity.

Od 4. týdne po infekci se začínají objevovat protilátky IgG. V většina infekcí titr postupně zvyšuje od maxima v různých časech (v průměru 1,5 do 2 měsíců), pak se titr zůstává na nízké úrovni, a ukazuje na imunitní systém. V některých onemocnění (mykoplazmóz, chlamydie, trichomoniáza) hladina IgG není vysoká, významně klesá z důvodu nedostatku imunity u těchto infekcí.

Možnosti pro detekci protilátek různých tříd:

- Izolované protilátky IgM předpokládá, že primární

infekce.
- Současná detekce IgM a IgG krve typické pro primární infekce
v posledních 2-3 měsíců, jakož i exacerbace chronické onemocnění. To znamená, že přítomnost IgM v těhotenství není vždy známkou primární infekce.
- Identifikace izolovaného IgG může naznačit, jak imunitu k nemoci,
a chronická infekce. V druhém případě je důležité, a počet protilátek (titru) a změna dynamiky titru. Typicky, studie provedené v intervalu 2-4-6 týdnů.

- Detekce IgA nebo IgM izolaci označují primární infekci. Na
vzhled IgA IgG očekává aktivaci chronické infekce (o průměru 2 týdny ode dne zhoršení).

Stanovení avidity IgG protilátek je vynikající komplementární etapa diagnóza primární infekce ze starých infekcí, která má své klinický význam, a to zejména při posuzování rizika intrauterinní infekci plodu. Detekce IgG nyzkoavidnyh označuje primární infekci a jsou v průměru 4 až 6 měsíců po infekci, zřídka déle. Nyzkoavidnyh IgG vyžadovat další laboratorní důkaz primární infekce (IgM). Vysokoavidni protilátka je buď známkou chronického onemocnění a jeho exacerbace, nebo tvarované imunita.

Funkce v kojenců:Děti do jednoho roku a někdy i 1,5 rok v mateřské krvi cirkulujícího IgG vůči infekcím (že byl jejich průnik přes placentu z matky na plod v děloze). To není samo o sobě známkou infekce současnosti. Pokud takjm věku jsou IgM (připomeňme, že mateřská IgM proniknout placentou nemůže), pak je to známkou infekce plodu nebo infekce získané po narození.

Kvantitativní metoda ELISA

Výsledek ELISA diagnostiky (pomocí analyzátoru ELISA) se objeví v některých jednotkách:
- Optická hustota (OP) vzorku - koncentrace specifických protilátek v jednotce objemu. Vyšší Vzorky OP, tím vyšší je koncentrace protilátek. Některé výsledky se vztahuje k poměru pozitivity (CP), - toto je také optická hustota vzorku.
- Jednotky koncentrace protilátek (nanohramm / mililitr, nebo ng / ml).
- Za sérových titrů: 1:20, 1:40, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1200, a tak dále. Diagnostické titry (ve kterém je nemoc diagnostikována, a nikoliv skutečnost, že infekce) pro různé onemocnění jsou rozdílné.

- Ve formě symbolů - "+", "-", (+, ++, +++, ++++) "?".
- V rámci kvalitativního hodnocení daného kritéria (pozitivní nebo negativní).

Správně odhadnout množství detekce protilátek možnosti třídy IgG, a proto, půdu onemocnění a je třeba pro ošetření může pouze lékař.

Nesmíme zapomínat, že pro každý testovací systém vyvinutý jejich "referenčními hodnotami" (pravidla Variant), nad kterou a diagnostikována určitou chorobou (Volby patologie). Pro různé testovací systémy "referenční hodnoty" jsou různé.

Správné porovnání výsledků IFA, přijatá v dynamice, je to možné pouze v případě výroby ve stejné laboratoři.